無菌操作實驗注意事項

一、 樣品采集及處理要求

1、所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環境衛生狀況等進行詳細調查，檢查是否有污染源存在。

2、根據食品的種類及數量，采樣數量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。

3、采樣應注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環境中微生物污染，容器不得使用煤 酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒-藥物滅菌，更不能含有此類消毒-藥物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應用。

4、樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1～5℃環境中，如需冷凍者，則在凍存狀態下送檢。

5、檢驗室收到樣品后，進行登記（樣品名稱、送檢單位、數量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，如果發現有下列情況之一者，可拒絕檢驗。
（1）樣品經過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。
（2）瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。
（3）按規定采樣數量不足者。
對送檢符合要求的樣品， 檢驗室收到后，應立即進行檢驗，如果條件不具備，應置4℃冰箱存放，及時準備創造條件，然后進行檢驗。

6、樣品檢驗時，根據其不同性狀，進行適當處理。
（1）液體樣品接種時，應充分混合均勻，按量吸取進行接種。
（2）固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml 滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質器攪碎混勻后，按量吸取接種。
（3）瓶、袋裝食品應用滅菌操作啟開，根據性狀選擇上述方法處理后接種。

二、無菌間使用要求

1、無菌間通向外面的窗戶應為雙層玻璃，并要密封，不得隨意打開，并設有與無菌間大小相應的緩沖間及推拉門，另設有0.5-0.7平方米的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。

2、無菌間內應保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關的物品。
      
3、無菌間使用前后應將門關緊， 打開紫外燈，如采用室內懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。 
    
4、處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。      

5、在無菌間內如需要安裝空調時，則應有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養基、被污染和接種的培養物等，必須經滅菌后方能使用。

（一）干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法

1、滅菌前準備
（1）所有需要滅菌的物品首先應清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如 用金屬筒應將上面通氣孔打開。
（2）裝培養基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包 好。

2、裝放
（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。
（2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內，物品之間不能過擠。

3、設備檢查
（1）檢查門的開關是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。
（2）檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應按下列步驟進行：
①手提式高壓鍋在主體內加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復使用時應將水 量補足，水變混濁需更換）；
②手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）；
③蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10-15min）；
④關閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規定要求，并維持規定時間（按滅菌物品性質與有關情況而定）；
⑤達到規定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復到零時，自然冷卻至 60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復至零，溫度降到60℃以下再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。   
（3）臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行：
①關緊鍋門，打開進氣閥，將蒸氣引入夾層進行預熱，夾層內冷空氣經阻氣器自動排出；
② 夾層達到預定溫度后，打開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內冷空氣經鍋室阻氣器自動排出；
③待鍋室達到規定的壓力與溫度時，調節進氣閥，使保持恒定至滅菌完成；
④自然或人工降溫至60℃再開門取物，不得使用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體劇烈沸騰或容器爆破；
⑤使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關緊門后，應根據物品類別按 動相應開關，以便按要求程序自動進行滅菌，滅菌時必須利用附設儀表記錄溫度與時間以備查，操作要求應嚴格按照廠家說明書進行。

4、滅菌溫度與時間
（1）干熱滅菌器滅菌溫度160℃，1.5-2h。
（2）壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間一般為121℃,15min。

（二）間歇滅菌方法
1、滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質經高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。
（1）將欲滅菌物品置于鍋內，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內余水排盡；
（2）關閉排水口，打開進氣門，根據需要消毒10～20min；    
（3）滅菌完畢關閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。

2、血清凝固器使用方法，培養基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營 養成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。
（1）在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經滅菌后使用；
（2）將培養基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75～90℃1h滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。

3、煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5～15 min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5 min，加入0.02%甲醛，80℃煮60 min均可達到滅菌目的， 但選用 煮沸消毒的增消劑時， 應注意對物品的腐蝕性。

4、滅菌處理：滅菌后物品，按正常情況已屬無菌，從滅菌器中取出應仔細檢查放置，以免再度污染。    
（1）物品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品使用；   
（2）取出的物品，如為包裝有明顯的水浸者，不可作為無菌物品使用；
（3）培養基或試劑等，應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態，未達到者應廢棄；
（4）啟閉式容器，在取出時應將篩孔關閉；
（5）取出的物品掉落在地或誤放不潔這處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用；
（6）取出的合格滅菌物品，應存放于貯藏室或防塵柜內，嚴禁與未滅菌物品混放；
（7）凡屬合格物品，應標有滅菌日期及有效期限；
（8）每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數量、溫度、時間、操作者。


四、有毒有菌污物處理要求

微生物實驗所用實驗器材、培養物等未經消毒處理，一律不得帶出實驗室。
1、經培養的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中存放在地點，待統一進行高壓滅菌。

2、經微生物污染的培養物，必須經121℃ 30min高壓滅菌。

3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，zui少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經121℃ 30 min高壓滅菌。

4、涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯 中，經高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。

5、打碎的培養物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。

污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口-罩等，應放入消毒袋內，經高壓滅菌后方能洗滌。
   

五、培養基制備要求

培養基制備的質量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養要求不*相同，培養目的的不同，各種培養基制備要求如下：
1、根據培養基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應用的試劑藥 品應進行質量檢驗。

2、PH 測定及調節：PH測定要在培養基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應再測試一次。培養基 PH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。但需注意因高壓滅菌可 影響一些培養基的 PH 降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數太多，以免影響培養基 的質量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調完PH后再加入。

3、培養基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養基加熱煮沸后，可用脫脂棉 花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預先洗凈晾干后使用，避免因瓊脂含雜質而影響透明度。

4、盛裝培養基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質玻璃容器為好。

5、培養基的滅菌既要達到*滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養價值，一般121℃15min即可，如為含有不耐高熱物質的培養基如糖類、血清、明膠等，則應采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入。

6、每批培養基制備好后，應做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養基，使用標準菌株接種培養，觀察生化反應結果，應呈正常反應，培養基不應貯存過久，必要時可置4℃冰箱存放。

7、目前各種干燥培養基較多，每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應觀察，各種培養基用相應菌株生長試驗良好后方可應用，新購進的或存放過久的干燥培養基，在配制時也應測PH，使用時需根據產品說明書用量和方法進行。

8、每批制備的培養基所用化學試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結果、制作人員等應做好記錄，以備查詢。


六、記錄和報告的要求
1、檢驗室收到樣品后，首行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗， 檢驗過程中要認真、負責、嚴格進行無菌操作，避免環境中微生物污染。

2、樣品檢驗過程中所用方法、出現的現象和結果等均要用文字寫出試驗紀錄，以作為對結果分析、判定的依據，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。

七、無菌操作要求

1. 接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。
     
2. 進行接種食品樣品時，必須穿的工作服、帽及拖鞋，應放在無菌室緩沖間， 工作前經紫外線消毒后使用。  
   
3. 接種食品樣品時，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球將手擦干凈。
     
4. 進行接種所用的吸管，平皿及培養基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。       

5. 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。
      
6. 接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取 出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。 
    
7. 接種環和針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環和針與桿的連接處，接種結核菌和烈性菌的接種環應在沸水中煮沸5min，再經火焰燒灼。

8. 吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。