一、配膠

注意一定要將玻璃板洗凈，zui后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面鄉下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

分離膠及濃縮膠均可事先配好(除AP及TEMED外)，過濾后作為儲存液避光存放于4度，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡(否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解于儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘)，加入10%AP(0.7~0.8：100,分離 膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5：100)及TEMED(分離膠用0.4：1000，15%的可用到0.3：1000，濃縮膠用0.8：1000)即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。

封膠：灌入2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度<10%時可用0.1%的SDS封，濃度>10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動。

待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。

4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正;若變形嚴重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長時間有利于膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。

(10%的AP現配現用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，棄掉.)

二.樣品處理

1.培養的細胞(定性)：

⑴ 去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細胞脫落)。

⑵ 對于6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

⑶ 100℃，1min。

⑷ 用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。

⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。

⑹ 待樣品恢復到室溫后上樣。

2.培養的細胞(定量)：

⑴ 去培養液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細胞脫落)。

⑵ 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲(100~200w)3s，2次。

⑷ 12000g離心，4℃，2min。

⑸ 取少量上清進行定量。

⑹ 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3.組織：

⑴ 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

⑵ 12000g離心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清進行定量。

⑷ 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM

由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。

1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巰基乙醇，0.2~0.5‰溴酚藍，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS終濃度勿超過10%。

對于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS，肝腎等組織2%即可。)

三.電泳

1.上樣前將膠板下的氣泡趕走。

2.所有蛋白樣品調至等濃度后上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調整至與樣品等體積。

2.以初始電壓為45V時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65V時改為穩壓電泳。

3.在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結束。

電泳液配方：Tris-base 3g, glycine 14.4g, 0.1% SDS(10ml 10% SDS)/L

Tris-base 1.5g, glycine 7.2g, 0.1% SDS(5ml 10% SDS)/0.5L

四.轉膜

1.電泳結束前20分鐘左右戴上手套開始準備：

濕轉使用常規電轉液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉則取此轉移液，每50ml加入10%SDS180ul。

浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后再*浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉入轉移液中。將濾紙也浸入轉移液中。

2.取膠：

將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠(以便以后雜其他感興趣的蛋白)，左上切角，在轉移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側一張(干轉每側三張)濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分(尤其是干轉，以防止短路)

3.轉膜：

濕轉：電轉槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊后放入電轉槽，注意膜在正極一側。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

干轉：用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。

電轉液配方： Tris-base 3g, glycine 14.4g, 200ml 甲醇/1L

五.封閉及雜交

1.封閉：

將膜從電轉槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色(2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液)觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。

2.結合一抗：

一抗的準備：使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。

反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發。

3.洗滌：

一抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4.結合二抗：

根據一抗來源選擇合適的二抗，根據鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋(1:1000~1:10000)，室溫輕搖一小時。

5.洗滌：

二抗孵育結束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

PBST： 1×PBS TTBS： Tris-HCl 20mM, pH 7.4 (25℃)

Tween-20 0.01% ~0.02% NaCl 150mM

Tween-20 0.05%

封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS，臨用時取200ml PBST或 TTBS加入10g脫脂奶粉即為封閉液。

六.發光鑒定

一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。

1.HRP-ECL發光法：

將A、B發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶(5min左右)后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。

2.AP-NBT/BICP顯色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個 EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體(如報紙)遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。

背景深淺與一抗的質量及二抗的量有關，當然如果暴光時間長達半小時，出現背景是正常的。

七.增強敏感性

若目的條帶未出現，或很淡，可試用以下方法增強發光強度：

用清水漂洗膜數分鐘，重加發光液進行曝光，可延長曝光時間。

將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。

封閉40~60min

一抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。

PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

二抗雜交，37℃ 1h。

PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

發光鑒定。

若條帶仍未出現或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

10.三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。

11.PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

12.發光鑒定。

一抗溶液中加入0.2% 疊氮鈉后可4℃存放至少2周(一個月我也用過，沒問題，再長時間還沒試)

八.NC膜的多次使用

一張NC膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與“七.增強敏感性”相近。

如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別則只需用PBST洗滌掉發光液(10min×3次)后從一抗雜交開始，后續步驟同前。

如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用 strip液(可用雜交袋)于室溫搖動洗滌30min~60min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續步驟同前。

對于雜交若干次的膜，如果常規洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液(可用雜交袋)于50℃洗滌30min，然后用PBST洗滌10min×3次，再從封閉開始，后續步驟同前。